2Dgel差异蛋白的寻找与鉴定
信息来源:西农生   更新时间:2008/10/19 13:01:05

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样品信息:
实验血清vs.对照血清
实验设计:为保证重复性,对同一实验血清(1B)和同一对照血清(1A)各进行3块双向电泳(银染),图象分析找出表达差异后对按用户要求对实验血清(1B)和对照血清(1A)各进行1块双向电泳(考染),对实验血清(1B)表达上调和下调的差异点进行酶切后质谱鉴定。
实验步骤:
1、总蛋白提取
2、总蛋白浓度测定
做标准曲线(如图1):使用经典bradford法定量。


图1


最终测定浓度为:实验组重复1B-1##ug/ul,实验组重复1B-2 ##ug/ul,实验组重复1B-3##ug/ul;对照组重复1A-1##ug/ul,对照组重复1A-2##ug/ul,对照组重复1A-3##ug/ul
3、蛋白的IEF 等电聚焦
本实验采用24cm pH3-10NL(非线性) IPG 胶条进行等电聚焦,采用水化与聚焦分别进行的策略。
4、IPG 胶条的平衡
IEF后胶条的平衡的目的就是利用还原剂打开蛋白质内部的二硫键,然后在用碘乙酰胺封闭还原后的巯基,SDS包裹在伸展肽链的周围,使得第二向电泳按照肽段的分子量进行分离。
5、第二向垂直平板电泳SDS-PAGE
6、双向电泳凝胶的染色、脱色及图像采集
所涉及到的仪器与软件:Umax powerlook2000扫描仪;软件。
7、图象分析实验结果
通过ImageMaster 2D Platium软件比对和人工检查,共找出##个差异蛋白,其中##个在实验组中(1B)表达量上调, ##个在实验组中(1B)表达量下调(图中为1B-1A表示以1B为参考胶,对比1A表达有差异的点。L1为图象比对的landmark)(如图2)

 
 
图2


8.切点及酶解:
所用酶:Roche Trypsin Sequencing Grade, modified
9.质谱鉴定:
此处举两例:单TOF鉴定的样品1; TOF/TOF鉴定的样品2
.质 谱 仪:Autoflex Ⅱ MALDI TOF/TOF
分析软件:FlexAnalysis3.0;


实验步骤
(一)实验质控
标准品自检
为避免峰值出现偏差,每4个样品数据采集前先做外标校正。
(二)样品检测及实验结果
样品1   MALDI-TOF结果:


    
根据单TOF结果进行比对,结果为蛋白A,giNO:##,SCORE 172, COVERAGE 31%
样品2      MALDI-TOF结果

 


二级TOF鉴定 MALDI-TOF结果中核质比为 ##的峰

  
根据双TOF结果,进行比对,结果为蛋白B,
giNO: ##  ,SCORE 55(有效值为大于35), COVERAGE 2%(数值为全蛋白的COVERAGE)

实验结果:实验组和对照组存在##个统计差别显著的蛋白点,质谱鉴定了其中##个蛋白其中##个为单TOF鉴定,1个为双TOF鉴定。