蛋白质的氨基酸序列检测服务
信息来源:本站原创   更新时间:2009/6/23 9:17:44

 

 

 1.N端测序

 

  

蛋白质的氨基酸序列检测服务

 

服务内容

   质谱方法在蛋白质测序中成为核心部分,带来的结果是蛋白质分析鉴定上的是高通量、自动化与精确性。同时Edman降解方法仍然是难度比较高的蛋白测序的重要补充。

本公司可开展蛋白质的N-端氨基酸序列测定工作:一次可以连续测定30个以上氨基酸

 

仪器(岛津PPSQ-21测序仪)

 

Edman化学降解测序介绍
    蛋白质和多肽N-端测序技术是以Edman化学降解法为基础的,Edman化学降解,其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基的偶联,苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)环化裂解,和噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH- 氨基酸)三个主要的化学步骤,每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基,同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个Edman降解,最后通过转移的PTH-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。因为技术原因,Edman降解无法处理N端被封闭的蛋白或多肽,例如N端被甲基化、乙酰化等的,这些蛋白多肽无法正常测序,如果确有必要的话可以考虑用蛋白酶将蛋白切割为多肽,对所得的多肽纯化后测序。因为蛋白测序判读的依据为每次化学降解所得到的氨基酸的色谱图,因此Edman降解法对于蛋白多肽的纯度要求比较高,一般要求在90%以上,而且不能含有诸如SDS等变性剂以及盐,并且对样品本身的绝对量要求也比较高。

 

应用领域

1.样品来源:动物,植物,微生物等

2.样品种类:天然蛋白,表达蛋白,融合蛋白,合成多肽等

3.纯化方式:液相纯化,二维电泳分离,PVDF转膜等

 

样品要求

1.含量:建议送样量不低于 50pmol

2.状态:液体、冻干粉或PVDF转膜样品均可

3.纯度:建议95%以上纯度

4.性质:注明其溶解性,挥发性,毒性/腐蚀性等

5.信息:表观分子量;修饰信息;样品组织来源及制备方法信息

6.其它:A. N端未封闭

B.缓冲液中不要包含氨基酸成分,如甘氨酸

C.不含干扰物质:去污剂、胺、盐、氨基酸、非挥发性缓冲液、蛋白酶等

D.样品需要转膜制备时,建议将样品交由我们代为处理,并同时提供相应的电泳方法与带有mark的电泳照片

E. 样品如有特殊理化性质(如膜蛋白,特殊酶活性,特殊结构等),请详细说明

F. 若为已知序列样品,请告知预期序列信息

实验结果

1、检测内容:纯蛋白质N-端氨基酸序列

2、报告内容:色谱图,N-端氨基酸序列,方法的基本描述

 

附:

蛋白测序常见技术问题


1、对于液体样品,应保藏于-20℃并尽快测试。
3、如果样品没有任何信号峰,要考虑蛋白N-端封闭。具报道约50%天然蛋白质N-端被修饰如乙酰化,甲酰化,焦谷氨酸化,须经蛋白质化学降解或酶切后分离后分析。有时样品在分离纯化中也会产生N-端封闭,主要由于溶液中去垢剂或化学物质与蛋白样品N-端功能基团反应,或者分离纯化中PH过高(PH>9)。

4、由于各种氨基酸残基化学或物理性质不同,因此判断其含量时PTH信号的强弱会发生变化。如:T和S因发生脱羟基而破坏,C被修饰很难有信号,H和R由于极性而难以萃取,M极易氧化而收率低。
5、修饰残基在检测时接近或覆盖已知氨基酸时会造成氨基酸识别错误。
6、普通PVDF膜的样品可能会因在测序反应过程中蛋白质从膜上脱离而导致信号衰减过快,测序长度过短。

 

 PVDF电泳与转膜时应注意的问题
1、对于PVDF膜样品,蛋白经凝胶电泳分离后,应马上进行电转移至PVDF膜上面,转膜前不能放置很久以防止样品扩散。
2、为防止部分蛋白质在电泳过程被胶内杂质封闭N末端,请预先自做预电泳。即用低电压跑空胶2-2.5h再上样电泳分离。
3、电泳过程中,要尽量避免条带拖尾现象,用于测序的条带要狭窄清晰。而且必须保证一定的量,测定20个氨基酸以上的蛋白质,至少需要3条以上的明亮,清晰的条带。
4、样品转膜后请用CoomassieR
250染色1分钟,避免使用CoomassieG250.。含样品的PVDF膜夹在滤纸间保存在密封塑料袋中,冰箱内可以放置3-6月(-20℃),电泳缓冲液需要使用CAPS缓冲液,而不要使用Tris-甘氨酸缓冲液。

 

 

实例
   


   

 

 

 

2.蛋白denovo测序:

 

适用于多氨基酸残基(如几百个以上)的多肽及蛋白测全长, 

 

酶切加质谱,软件分析

三种酶切法:
五种酶切法:
酶:Trypsin、Chymotrypsin、Glu-C、Lys-C、ASP-N